Bienvenue sur notre site consacré à la culture in vitro

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Nous sommes trois lycéens de la 1eS1 au lycée André Boulloche.
C'est dans le cadre des travaux personnels encadrés que nous avons crée ce site internet sur la culture in vitro.

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En vous souhaitant une bonne visite,

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______________Marie Rodrigues, Grégoire Maisonneuve et Caroline Trin

Introduction

__Dans le cadre de ce TPE, nous traiterons de la culture in vitro . Sur ce sujet, un fil directeur a été le nôtre : l’idée de révolution. En effet, l’application de cette nouvelle technique n’est pas sans conséquences sur l’économie du monde agricole et sur notre environnement. Nous nous sommes alors demandés quels pouvaient être les apports, aussi bien positifs que négatifs, de cette technique, somme toute récente. Une approche concrète de cette méthode a aussi permis d’apporter à notre problématique un regard « réellement » expérimental. Nous avons, pour ce faire, réalisé au lycée une culture en laboratoire de germes de pommes de terre. Nous montrerons dans cette production le bilan de cette expérience.
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__Nous avons choisi de traiter ce thème selon la problématique suivante : « Comment, malgré des difficultés de mise en œuvre, la culture in vitro végétale a-t-elle révolutionné, économiquement et écologiquement, le monde agricole ? ».
__Nous commencerons par définir le terme de « culture in vitro ». Dans un second temps, nous aborderons l’évolution historique de cette méthode de reproduction des végétaux depuis le début du XX° siècle. Nous expliciterons ensuite, les techniques possibles de la culture in vitro végétale. Parmi ces techniques, une a été retenue par notre groupe, la micropropagation, et sa mise en œuvre a fait l’objet de notre expérimentation. Enfin nous étudierons le questionnement de la problématique, c’est-à-dire les répercussions de cette technique sur le monde agricole. Nous distinguerons l’aspect économique de l’aspect écologique.

SOMMAIRE

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I. Qu'est-ce que la culture in vitro ?

___1. Définition et caractéristiques
___2. Quelques grandes dates

II. Les techniques de la culture in vitro

___1. La micropropagation, ou clonage végétal
___2. Autres techniques envisageables

III. Des difficultés de mise en oeuvre

___1. Expériences: culture in vitro de la pomme de terre
______a-Protocole expérimental
______b-Résultat et suivi de l'expérience 1
______c-Résultat et suivi de l'expérience 2
___2. Conditions de culture

IV. Les évolutions économiques et écologiques apportées par la culture in vitro dans le domaine agricole
___1. Évolutions économiques

___2. Évolutions écologiques

I. Qu'est-ce que la culture in vitro ?

___1. Définition et caractéristiques

__On qualifie d'in vitro (par opposition a in vivo = dans le vivant) toute exploration ou expérimentation biologique qui se fait en dehors de l'organisme d’origine (dans des tubes, éprouvettes, etc.). La culture in vitro, effectuée en laboratoire, est une technique visant à régénérer une plante à partir de cellules ou de tissus végétaux mis en culture sur des milieux nutritifs spécifiques ; dans des conditions stériles, un environnement contrôlé (température, pH et éclairement) et un espace réduit (ces plantes sont miniaturisées).

__Elle est notamment utilisée afin de :

-garder des plants stériles,

-modifier le génotype d’une plante (introduire un nouveau caractère ou supprimer un caractère -préexistant),

-produire plus rapidement une large quantité de plantes et réduire les coûts de production,

-conserver et multiplier des plantes rares ou difficiles à trouver dans le commerce,

-créer de nouvelles plantes appelées plants génétiquement modifiés (biotechnologie végétale).

__Grâce a la culture in vitro, des plantes entières sont régénérées a partir d’un fragment végétal : Il s’agit donc d’une technique de clonage. Les clones obtenus possèdent donc le même patrimoine génétique que la plante mère.

__Parmi les premiers succès de la transgénèse végétale figurent notamment les plantes résistant aux herbicides et aux insectes.

___2. Quelques grandes dates
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«La régénération d’une plante entière, qu’elle se produise naturellement ou in
vitro à partir d’explants mis en culture, implique que certaines cellules d’une
plante adulte puissent se multiplier et produire par différenciation tous les
types cellulaires de la plante. »

__Cette propriété, appelée totipotence cellulaire végétale, est énoncée par Haberlandt en 1902. Elle permet la multiplication végétale et est la théorie de base de la culture in vitro.

__En 1928, le chercheur Went découvre l’auxine, première substance de croissance détectée grâce au « test Avena ».
__Quelques temps après, en 1950, des chercheurs découvre l’existence et les propriétés d’autres hormones de croissances végétales (notamment la cytokinine) qui contrôlent la rhizogénèse (formation des racines) et la caulogénèse (formation des tiges). Les hormones de croissance sont indispensables au développement d’une plante et doivent être fournies aux cellules en culture.
__Dans les années 1970, les scientifiques comprennent ce que pourrait apporter la culture in vitro dans le domaine de la recherche et de l'économie. En effet, à partir d’un bourgeon, on peut obtenir plusieurs millions de nouvelles plantes en moins d’un an.
__Ce n’est pourtant qu’en 1983 que la première plante transgénique est crée. Il s’agit d’une plante de tabac qui résiste au kanamycine, un antibiotique. Cette découverte ouvre la voie à l’incorporation de caractéristiques spécifiques dans des plantes.

__Deux ans après, aux Etats-Unis, les premiers essais en champ de plantes transgéniques résistantes à un insecte, un virus ou une bactérie ont lieu. La commercialisation de plantes transgéniques comme le maïs ou le soja génétiquement modifiés est autorisée en 1994 pour les Etats-Unis (la première plante commercialisée est une tomate à longue conservation) et dans les années 1996-1997 pour les quinze pays de l’Union Européenne de l’époque.

II. Les techniques de la culture in vitro

___1. La micropropagation, ou clonage végétal


__C’est la technique que nous avons utilisée pour notre expérience.

__Des explants issus d’une plante mère sont placés sur un milieu de croissance stérile (qui comprend du saccharose comme source d’énergie, des oligoéléments comme nutriments) et dans un environnement avec une température, un taux d’humidité, une luminosité contrôlés.
On obtient ainsi des plantes identiques génétiquement à la plante de départ en grande quantité grâce au phénomène de totipotence des cellules végétales (la totipotence ou la multiplication végétative est un processus spécifique des plantes. Chaque cellule possède en effet les potentialités nécessaires et suffisantes pour se multiplier, pour s’organiser en tissus différents permettant de reconstruire la plante.)


__Cette technique comprend 4 étapes :
- L’initiation ou la mise en place des cultures, c’est l’étape la plus délicate et difficile qui permet d’obtenir le cal : amas de cellules indifférenciés capables de fournir des cals de seconde génération et de générations ultérieures.
- La multiplication
- L’enracinement
- Le sevrage et l’acclimatation.

__Lors de notre expérience, nous avons réalisé seulement les trois premières étapes, dans le temps imparti.

___2. Autres techniques envisageables


__La culture de méristèmes ou l’élimination de virus : les méristèmes sont des zones de cellules à divisions intenses, situés au cœur des bourgeons et des extrémités des racines, qui, lorsque la plante est atteinte par un virus ou une bactérie, sont indemnes. D’ou l’idée de régénérer une plante a partir des méristèmes. La dissection se fait sous loupe binoculaire et la culture s’effectue à température élevée pour favoriser l’élimination des virus. Cette expérience permet la repousse saine d'un plant à l'origine malade, mais en aucun cas la future plante sera immunisée contre les virus.

__L’embryogénèse somatique : c’est une forme de multiplication végétative qui permet d’obtenir des plantules génétiquement identiques à la plante donneuse d’explants. C’est l’obtention d’embryons à partir de cellules non sexuées.

__L’halo-diploidisation ou la création de lignées pures : Ces plantes sont issues d’une cellule mâle ou femelle sans fécondation. Elles peuvent être obtenues par androgenèse (développement d'une plante à partir d'un gamète mâle) ou par gynogenèse (développement d'une plante à partir d'un gamète femelle).

III. Des difficultés de mise en oeuvre

___1. Expériences de la culture in vitro de pomme de terre
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_________a. Protocole expérimental

matériel:
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Réalisation du milieu de culture:
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Diluer l’agar : 8g/l donc 2g (pour 250 ml) a diluer dans 250mL d'eau distillée.
Rajouter les oligoéléments dans la solution, en réajustant leur posologie pour 250 ml.
Faire chauffer le tout au bec Bunsen jusqu’à ce que la solution devienne presque transparente.
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On prélève 2mL de KNOP (engrais) dans la solution.



On rempli 10 tubes a essais avec le milieu de culture.



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Préparation et désinfection des explants:
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Plonger les germes dans l'alcool a 70°.
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Plonger successivement les germes dans 3 bains d'eau distillée pour les rincer.

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Mise en culture:
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Introduire les portions de tiges coupés dans les tubes a essais avec le milieu de culture. Il faut faire attention a les placer a l'endroit.
Placer les tubes à essais dans un environnement à 25°C.

______b-Résultat et suivi de l’expérience 1

La première tentative de mise en culture est un échec. La perte de la plupart de nos explants est due au milieu de culture que nous avons malheureusement pas dosé correctement. Après une attente d’une semaine, un seul tube à essais semble convenable pour la suite de notre expérience, nous avons donc suivi son développement.

Nous avons constaté le desséchement de l’explant du à une concentration trop faible en Agar dans le milieu de culture : l’eau s’est évaporée.

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______a-Résultat et suivi de l’expérience 2

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__Globalement nous avons mieux réussi cette expérience que la précédente. Nous n'avons pas préparé nous-mêmes les milieux de culture car nous les avions déjà plus ou moins ratés lors de notre dernière expérience.
__Dans l’un des tubes à essais, une racine c’est développée mais nous avons pu constater, par la suite l’apparition de moisissure autour de l’explant. Néanmoins ce dernier a engendré une pousse.

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___2. Conditions de culture


Avantages : les plantes obtenues sont génétiquement identiques à la plante de départ
La production d'une plante est programmée sans tenir compte des saisons.

Inconvénients : les conditions stériles sont primordiales à obtenir afin qu’aucun champignon ou bactérie ne viennent coloniser les milieux de culture. L'asepsie doit etre quasiment totale et est très difficile a obtenir. En effet, nous avons vu lors de notre expérience qu'il faut porter un masque, des gants et une blouse, nettoyer le plant de travail et manipuler autour du bec Bunsen afin qu'aucune bactérie ne se développe; pourtant, malgré ces protections, notre "milieu de travail" n'était pas stérile.

IV. Les évolutions économiques et écologiques apportées par la culture in vitro dans le domaine agricole

__Tout d’abord, il convient de se demander comment est utilisée la culture in vitro dans le domaine de l’agriculture.
__Car cette contribution indirecte à l’évolution des techniques agricoles s’opère bien loin du champ. En effet, cette technique se déroule en laboratoire et nécessite par conséquent de lourds investissements. On pourrait distinguer deux types de culture in vitro végétale. La première serait la reproduction en masse d’une plante à partir d’une plante mère sans que l’on touche à son patrimoine génétique. La seconde se différencierait de la première par les modifications que l’on apporterait à sont information génétique. On retrouve ce type de plantes sous l’appellation, moins barbare, d’OGM. Nous nous intéresserons donc plus en détails à cette seconde catégorie mais cette révolution relativement récente du monde agricole est donc à analyser avec du recul.

___1. Évolutions économiques


__Jusqu’à présent, un cultivateur prélevait une partie de ses récoltes afin de semer l’année suivante son champ. Il apparaît clairement que ce temps est révolu. Après avoir rencontré beaucoup d’obstacles, la transgénèse des végétaux et notamment des plantes ayant vocation à être cultivées est devenue une réalité scientifique mais surtout économique. En trois ans (de 1996 à 1999) la totalité des surfaces de plantes transgéniques plantées dans le monde est passée de 3 millions d’hectares à 40 millions : le marché de celles-ci est donc en pleine expansion. A l’heure où un nombre incommensurable de plantes transgéniques (et les herbicides qui les accompagnent) fleurissent sur le marché, il est nécessaire de se poser la question : « A qui profite ce profond bouleversement ? »
__A première vue, il profite aux agriculteurs. Les « mauvaises herbes » sont responsables d’une diminution du rendement des cultures (environ 10%) mais les herbicides classiques destinés initialement à les éradiquer atteignent souvent les plantes qu’ils sont censés protéger. Leur utilisation n’est donc pas profitable à l’agriculteur. Avec l’utilisation de plantes transgéniques résistantes aux herbicides( comme le colza ou le soja ), le champ peut donc être débarrassé des ses mauvaises herbes tout en préservant les cultures. Mais qu’en est-il des ravages causés par les insectes ? Avec la même technique, un transfert de gènes, on permet à la plante (comme le maïs ou le coton) de se défendre seule contre les insectes. Il n’y a plus de risque de lessivage de l’insecticide par la pluie et permet donc l’économie d’épandages d’herbicides ou d’insecticides à répétition aussi toxiques qu’onéreux.
__Il est aussi possible d’obtenir des résistances aux métaux lourds, à l’acidité d’un sol, aux sels, au gel, à l’excès de lumière, à l’irradiation aux ultraviolets ou bien même à la sécheresse. Par exemple, par ajout d’un gène, le tabac ou les fraises sont rendus moins sensibles au froid.
Par ces modifications génétiques, « l’Homme » évite donc la perte d’une partie de ses récoltes et peut, qui plus est, se permettre de cultiver sur des surfaces a priori plus difficiles à exploiter.
__Mais au-delà de ces aspects économiques plutôt positifs, quelle réalité se cache derrière l’emploi de ces plantes génétiquement modifiées ? Il est évident que l’élaboration et la production de semences de plus en plus complexes nécessitent des moyens financiers colossaux. Cette difficulté de mise en œuvre de la culture in vitro conduit ainsi à un constat alarmant : 99% des OGM végétaux transgéniques mondiaux sont commercialisés par seulement cinq multinationales puissantes. Ces quelques firmes détiennent donc un pouvoir énorme. On citera surtout Monsanto, Du Pont, Novartis, Zeneca ou Aventis. Les enjeux sont énormes et se comptent en milliards de dollars. Comment ne pas craindre un « asservissement » progressif des agriculteurs toujours plus nécessiteux, pour rester compétitifs, des dernières innovations produites par ces mêmes « géants » ? C’est une relation de dépendance qui s’installe entre les leaders du secteur et les agriculteurs. Si certains agriculteurs des pays développés refusent, par choix, une telle orientation, d’autres, comme les paysans du Sud ne peuvent tout simplement pas se le permettre. Comment un agriculteur aux ressources pécuniaires infimes pourrait-il acheter à la fois les semences transgéniques et le pesticide qui leur correspond ? On peut donc appréhender, pour demain, la mise en place d’un monopole de la vente des semences par quelques grandes firmes qui se sont dès aujourd’hui accaparées la vente des pesticides.

___2. Évolutions écologiques


__On mesure encore mal l’impact des plantes transgéniques sur notre environnement et le désordre écologique qu’elles pourraient causer. L’évolution de celle-ci et de leurs gênes au sein des écosystèmes auxquels elles appartiennent est un problème majeur car la durée de survie dans le sol des bactéries au patrimoine génétique modifié semble plus importante que prévue. Par crainte d’une dissémination accidentelle de ces micro-organismes on travaille dans les locaux aussi étanches que possible avec une hygiène irréprochable.

__Toutefois, lorsque la culture de ces plantes se fait en conditions naturelles il existe des facteurs de dissémination incontrôlables : le vent, l’eau, les animaux et l’homme transportent leurs pollens, leurs graines ou leurs plantules. Dans ces conditions, ne faut-il pas alors craindre des transmissions involontaires de gênes entre plantes « sauvages » et modifiées ? Des plantes, comme le colza ou l’endive transgénique auront donc la possibilité de transmettre leurs transgènes de résistances aux herbicides à des mauvaises herbes lors de croisements naturels. Elles donneraient naissance à de « supermauvaises herbes » dont il serait presque impossible de se débarrasser. Dans cette hypothèse, des phénomènes invasifs de certaines espèces sont à prévoir. Prenons un exemple : le maïs transgénique. On a introduit un gène à ce dernier « Bt » ( Bacillus thuringiensis) qui est producteur d’une molécule insecticide censé résister à la pyrale. La plante sécrète donc d’elle même ce pesticide, non toxique pour l’Homme mais mortel pour ce papillon. Néanmoins, il est avéré que la pyrale développera à terme une résistance à cet insecticide. Le « Bt », pesticide d’origine naturelle ne sera plus d’aucune utilité. Ce cas peut être généralisé et l’on se rend compte que le transfert incontrôlé de gènes est un sérieux problème car il faudra sans cesse changer de traitement pour un produit certainement plus toxique que le précédent. Qu’adviendra-t-il alors de la culture biologique qui n’utilise que le « Bt » ? On le voit bien, la porosité des barrières entre espèces affines pose donc un problème de taille, car si une espèce devient beaucoup plus compétitive qu’une autre, n’y a-t-il pas aussi un risque pour la biodiversité ?


__Enfin, la manipulation à outrance des plantes n’est pas sans danger. En introduisant des nouveaux gènes dans une plante, on peut arriver à des effets néfastes et inattendus comme l’apparition d’allergies, de nouvelles toxicité ou bien l’augmentation d’une toxicité naturelle. Une plante supposée se défendre contre un organisme pathogène (un virus ou un insecte) peut au final être toxique ou allergisante pour le consommateur. Un soja auquel on avait ajouté un gène afin d’améliorer ses qualités nutritives s’est avéré allergénique.
On constate donc que la culture in vitro lorsqu’elle a pour but de modifier génétiquement une plante, n’est pas toujours bénéfique. Les apports ne sont pas forcément positifs aussi bien économiquement qu’écologiquement.

Conclusion

__Nous avons donc pu constater, que par bien des manières la culture in vitro a révolutionnée le monde agricole. Elle est une innovation majeure de la fin du XXe siècle car sa méthode même est extraordinaire. Comment aurait-on pu imaginer qu’un jour l’Homme puisse contrôler à ce point la nature ? Les scientifiques réussissent aujourd’hui à modifier ce que l’évolution a mis des millions d’années à engendrer ! Ce bouleversement de « l’ordre établi » présente des aspects positifs, c’est indéniable. Des applications au progrès de la médecine ont été trouvées. On trouve par exemple, un colza auquel on a ajouté un gène de sangsue qui produit un anticoagulant d’un intérêt hautement thérapeutique : l’hirudine. Il existe sur cette même plante, une autre manipulation qui la conduit à sécréter une enzyme précieuse dans la lutte contre la mucoviscidose. Le « riz doré » destiné au pays du Tiers-Monde est un riz auquel des chercheurs suisses avaient ajouté trois gènes nécessaires à la fabrication du bêta-carotène. On ne s’est pas arrêté à une seule modification : on y a inséré des gènes favorisant l’assimilation du fer, plus révolutionnaire encore, on vise l’ajout d’un gêne (construit de toutes pièces) permettant la synthèse d’une protéine constituée d’acides aminés dont le corps est dépendant mais qu’il est cependant incapable de fabriquer.
__Derrière ces actions que l’on pourrait qualifier presque de philanthropiques se profile une réalité moins appréciable. La culture in vitro a eu indirectement, en effet, plusieurs impacts sur l’économie du monde agricole et les dégâts qu’elle provoque sur les écosystèmes ne sont pas encore bien connus.

__Les manipulations génétiques n’ont donc pas fini de faire parler d’elles… Mais il est une constante que nous nous devons de garder en tête, nous sommes dépendants de la nature mais l’inverse n’est pas vrai :c’est pourquoi elle est à traiter avec respect et l’on ne peut pas « jouer » aux apprentis-sorciers car il sera bien difficile de rattraper les erreurs commises. Comme le disait déjà Goethe :

« la nature n’admet pas la plaisanterie ; elle est
toujours vraie, toujours sérieuse, toujours sévère ; elle a toujours
raison. Les fautes et les erreurs viennent toujours de l’Homme »